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線粒體膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由線粒體內(nèi)外膜成分構(gòu)成的非特異性且鈣離子依賴性通道。在細(xì)胞凋亡或壞死時，線粒體內(nèi)容物通過膜通道孔釋放到胞漿中。膜通道孔的誘導(dǎo)開放，顯著改變線粒體的通透性，小于1500 D的溶質(zhì)可以自由進(jìn)出線粒體。鈣離子過度進(jìn)入、線粒體谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等導(dǎo)致膜通道孔的持續(xù)開放，而造成細(xì)胞色素C的釋放和線粒體膜電位的消失，觸發(fā)細(xì)胞凋亡和壞死。而環(huán)胞霉素A （cyclosporin A；CsA）、氟比嗪（trifluoperazine）和氯化鎂等則抑制膜通道孔誘導(dǎo)開放。使用分光光度儀（波長540nm或440nm）檢測線粒體的體積（膨脹性）變化，來分析和觀察線粒體膜通道孔開放狀態(tài)，即線粒體膜通道孔開放，線粒體容積增大（線粒體膨脹），光散射性降低。 
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO緩沖液（Reagent A）   5毫升
HEPENGBIO誘導(dǎo)液（Reagent B） 200微升
HEPENGBIO抑制液（Reagent C） 200微升
產(chǎn)品說明書   1份
 
保存方式
 
保存在4℃冰箱里，有效保證6月
 
用戶自備
 
比色皿或96孔板：用于線粒體光度分析的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于線粒體光度定量分析
 
實驗步驟
 
實驗開始前，開啟并設(shè)定好分光光度儀或酶標(biāo)儀（溫度為25℃）：波長540nm或440nm，間隔30秒測讀1次，持續(xù)10分鐘至30分鐘，并置零
 
 
一、 誘導(dǎo)劑檢測
 
1． 準(zhǔn)備好待測的純化線粒體樣品
2． 移取20微升線粒體樣品（總量為200微克）到比色皿或96孔板的對應(yīng)孔里
3． 加入170微升室溫預(yù)熱的HEPENGBIO緩沖液（Reagent A），混勻
4． 即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀（波長540nm或440nm）：獲得0分鐘初始讀數(shù)（Initial A540）
5． 動態(tài)測讀1分鐘或室溫下靜置1分鐘
6． 即刻加入10微升HEPENGBIO誘導(dǎo)液（Reagent B）或用戶自備的待測誘導(dǎo)劑，混勻（注意：可以設(shè)定不同濃度梯度）
7． 即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀（波長540nm或440nm）：動態(tài)記錄10分鐘吸光值變化或設(shè)定時間點記錄實際吸光值――吸光值降低，表明誘導(dǎo)膜通道孔開放活性（MPTP）增強，即膜通道孔功能正常
8． 計算吸光值比值（A540/Initial A540）：設(shè)定時間點實際吸光值/0分鐘吸光值――吸光值比值降低，表明誘導(dǎo)膜通道孔開放活性（MPTP）增強，即膜通道孔功能正常
9． 構(gòu)建膜通道孔誘導(dǎo)開放曲線：縱座標(biāo)（Y）為實際吸光值或吸光值比值（A540/Initial A540），橫座標(biāo)（X）為時間（秒）
10． 或構(gòu)建膜通道孔誘導(dǎo)開放-藥物濃度關(guān)系曲線：縱座標(biāo)（Y）為實際吸光值或吸光值比值（A540/Initial A540），橫座標(biāo)（X）為藥物濃度
 
二、 抑制劑檢測
 
1． 準(zhǔn)備好待測的純化線粒體樣品
2． 移取20微升線粒體樣品（總量為200微克）到比色皿或96孔板的對應(yīng)孔里
3． 加入160微升室溫預(yù)熱的HEPENGBIO緩沖液（Reagent A），混勻
4． 即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀（波長540nm或440nm）：獲得0分鐘初始讀數(shù)（Initial A540）
5． 動態(tài)測讀1分鐘或室溫下靜置1分鐘
6． 加入10微升HEPENGBIO抑制液（Reagent C）或用戶自備的待測抑制劑，混勻（注意：可以設(shè)定不同濃度梯度）
7． 動態(tài)測讀2分鐘或室溫下靜置2分鐘
8． 即刻加入10微升HEPENGBIO誘導(dǎo)液（Reagent B），混勻
9． 即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀（波長540nm或440nm）：動態(tài)記錄10分鐘吸光值變化或設(shè)定時間點記錄實際吸光值――吸光值不變，表明抑制膜通道孔開放活性（MPTP）增強，即膜通道孔功能正常
10． 計算吸光值比值（A540/Initial A540）：設(shè)定時間實際吸光值/0分鐘吸光值――吸光值比值不變，表明抑制膜通道孔開放活性（MPTP）增強，即膜通道孔功能正常
11． 構(gòu)建膜通道孔誘導(dǎo)開放曲線：縱座標(biāo)（Y）為實際吸光值或吸光值比值（A540/Initial A540），橫座標(biāo)（X）為時間（秒）
12． 或構(gòu)建膜通道孔誘導(dǎo)開放-藥物濃度關(guān)系曲線：縱座標(biāo)（Y）為實際吸光值或吸光值比值（A540/Initial A540），橫座標(biāo)（X）為藥物濃度
 
注意事項
 
1． 本產(chǎn)品為20次操作
2． 本產(chǎn)品用于膜通道孔的功能檢測、以及誘導(dǎo)劑和抑制劑篩選
3． 操作時，須戴手套
4． 使用時，避免污染母液，尤其是HEPENGBIO緩沖液（Reagent A）
5． 線粒體樣品中忌用磷酸鹽、EDTA、鈣鎂離子等處理
6． 建議使用未經(jīng)誘導(dǎo)或抑制處理的樣品作為陰性對照
7． 可以動態(tài)檢測10分鐘或30分鐘  
8． 可以使用540nm波長的濾波器或者440nm波長的濾波器
9． 可以使用分光光度儀檢測，0.2毫升比色皿替代96孔板
10． 540nm波長的0分鐘讀數(shù)通常0.8為理想狀態(tài)；而440nm波長的0分鐘讀數(shù)通常0.2為理想狀態(tài)；其吸光讀數(shù)取決于線粒體的濃度
11． HEPENGBIO誘導(dǎo)液（Reagent B）加入后的任一檢測時間讀數(shù)低于加入前讀數(shù)表明膜通道孔開放
12． 如果膜通道孔為瞬時開放（transient），則吸光讀數(shù)緩慢降低
13． HEPENGBIO誘導(dǎo)液（Reagent B）含有氯化鈣，用戶可以使用其它誘導(dǎo)劑替代，例如磷酸鹽，二氧化鉀等
14． HEPENGBIO抑制液（Reagent C）含有EGTA，用戶可以使用其它抑制劑替代，例如環(huán)胞素A，ADP等
15． 本公司提供通用型膜通道孔抑制劑：HEPENGBIO 0.2毫摩爾環(huán)胞素A（cyclosporine A）－HEPENGBIO12226
16． 誘導(dǎo)或抑制再誘導(dǎo)檢測參考圖像如下